Expériences
Pcr

10b.
La PCR locus PV92

Pcr 2

Remarques:

1) Cette expérience a été mise en place afin de remplacer le protocole intitulé "PCR (locus D1S80)". L’amplification est en effet meilleure et les résultats plus simples à interpréter. Toutefois un nouveau propotocle PCR a été développé, intitulé "PCR sensibilité au PTC", qui permet de faire le lien entre un génotype donné et le phénotype associé. L'expérience d'amplification par PCR du locus PV92 peut encore être empruntée sur demande.

Voir le nouveau protocole "PCR sensibilité au PTC"


La technique de polymérisation en chaîne (en anglais « polymerase chain reaction ») ou PCR, permet d’amplifier des millions de fois un unique fragment d’ADN. Cette méthode est devenue un outil précieux non seulement pour la recherche en biologie moléculaire mais également pour le diagnostique médical, la détermination de microorganismes ou encore la criminologie. L’invention de la PCR revient à Kary Mullis dans les années 80. Il obtint pour cette découverte le Prix Nobel de Chimie en 1993. La découverte d’ADN polymérases thermorésistantes (la Taq polymérase par exemple) isolées de bactéries (Thermus aquaticus) vivant dans des sources d’eau chaude a facilité l’utilisation de la PCR et a permis son automatisation.

 

Thèmes : la PCR, la structure du génome humain, le génotypage, la criminologie, l’ADN, l’électrophorèse.

 

La PCR : Une réaction de PCR nécessite :

  1. de l’ADN à amplifier (dénommé template)
  2. des amorces (également appelés primers)
  3. des desoxynucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
  4. une  ADN polymérase thermorésistante (la Taq par exemple)
  5. du magnésium (Mg++) indispensable au fonctionnement de l’ADN polymérase

 

Ces 5 ingrédients sont mélangés dans un tube à essai et soumis à différents cycles de températures.

 

1cycle a

1ère étape : la dénaturation (94°C).
L’ADN template est chauffé à 94°C. Les deux brins de l’ADN se séparent. On parle de dénaturation de l’ADN.

2ème étape : l’hybridation (40-65°C).
En descendant la température, les amorces s’apparient (s’hybrident) par complémentarité à leurs séquences cibles sur l’ADN.

3ème étape : l’élongation (72°C).
A cette température, la Taq synthétise les brins d’ADN complémentaires en ajoutant des desoxynucléotides triphosphates à la suite des amorces. Le temps d’élongation dépend de la taille du fragment à amplifier et de la vitesse de polymérisation de l’enzyme (la Taq ajoute environ 1000 nucléotides par minute).

 

 

Ces trois étapes correspondent à 1 cycle de PCR, à la suite duquel on a doublé le nombre de fragment d’ADN cible initial. Environ une trentaine de cycle sont en principe effectués dans une expérience de PCR classique. Ainsi, après 30 cycles on aura amplifié 2n fois notre ADN cible.

 

Un schéma de l'amplification par PCR est visible ici:

 

Les séquences alu :
L’ADN humain est constitué  de nombreuses séquences répétées représentant plus de 50% du génome. Les séquences Alu font partie des éléments répétés les plus abondants. Il s’agit de courtes séquences d’environ 300 pb qui ont été mobilisées chez les primates il y a environ 65 millions d’années. Le nom de ces séquences vient du fait qu’elles possèdent un site de restriction pour l’enzyme AluI. La dispersion des séquences Alu dans le génome s’effectue en utilisant un intermédiaire ARN par un processus dénommé rétroposition. Ces éléments Alu contribuent à l’évolution du génome, à son architecture mais peuvent également être la cause de certaines maladies génétiques. Les séquences Alu continuent de se disperser à raison d’une insertion toute les 200 naissances.
Certaines séquences Alu se sont insérées récemment (il y a environ 1 million d’année) et ne se retrouvent pas chez tous les individus. Ce polymorphisme peut être utilisé pour l’étude des populations. Par exemple, le locus PV92 situé sur le chromosome 16 peut, suivant les personnes, contenir ou non une séquence Alu. Certains individus possèdent ainsi un élément Alu sur leurs 2 chromosomes 16 (+/+), ou sur l’un des 2 (+/-), on  pas d’insertion à ce locus (-/-).

L'EXPERIENCE:

Protocole :

1) Extraction d'ADN à partir de cellules épithéliales de la bouche

  • Mettre 500 µl d'H2O dans un tube Eppendorf
  • Frotter abondamment l’intérieur des joues avec un écouvillon (coton tige) stérile afin d’obtenir un maximum de cellules épithéliales
  • Tremper l'écouvillon dans le tube contenant les 500 µl d'H2O. Tourner l'écouvillon et le frotter contre les parois du tube
  • Bien essorer l'écouvillon en le sortant du tube
  • Centrifuger le tube 2 minutes à la vitesse maximum afin de faire tomber les cellules épithéliales.
  • A l’aide de la P1000 enlever le surnageant en prenant soin de laisser le culot de cellules au fond du tube. Attention à ne pas aspirer le culot de cellules. Le cas échéant centrifuger à nouveau la salive.
  • Ajouter 0.1 ml de solution de NaOH 200 mM sur le culot et le resuspendre en vortexant ou en pipetant à l'aide de la P1000
  • Fermer le tube et incuber à 95 °C  pendant 10 minutes dans le bloc chauffant
  • Vortexer brièvement
  • Ajouter 0.1 ml de HCl 200 mM dans votre tube.
  • Ajouter 0.1 ml Tris-HCl (pH 8.5) 200 mM dans votre tube.
  • Votre préparation d’ADN est prête et peut être stockée au congélateur ou utilisée directement pour la suite de l’expérience

2) Amplification par PCR

  • Préparer le mélange de réactif pour la PCR juste avant l'emploi. Ce mélange contient le 2 x Taq mix (taq polymérases, dNTPs, tampon de polymérisation et tampon de charge rouge), les primers et de l’H2O.
  • Pour une classe de 16 élèves par exemple, on compte 16 réactions plus un contrôle négatif ainsi qu'un contrôle positif soit un total de 18 réactions. Afin de faciliter le pipetage et pour avoir assez de matériel en cas d'erreurs nous prévoyons un mélange pour 24 réactions.
  1 réaction 24 réactions
2xTaq ReadyMix 12.50 µl 300 µl
Primers mix PV92 5.00 µl 120 µl
DMSO 1.25 µl 30 µl
H2O 1.25 µl 30 µl

 

  • Ce mélange est préparé dans un tube Eppendorf 1.5 ml juste avant l’emploi. Mélanger en pipetant en haut et en bas délicatement.
  • Distribuer ensuite les 20 µl du mélange dans les petits tubes de PCR préalablement marqué sur le côté par les initiales des personnes à tester.
  • Dans votre petit tube ajouter 5 µl de votre solution d’ADN. Fermer le tube.
  • Dans le petit tube PCR destiné au contôle négatif, ajouter 5 µl d’H2O à la place de l’ADN. Fermer le tube.
  • Dans le petit tube PCR destiné au contôle positif, ajouter 5 µl d’ADN B2B. Fermer le tube.
  • En suivant les instructions du mode d'emploi de la machine PCR, mettre les tubes dans la machine et lancer le programme PV92.
  • Le programme dure environ 1h30. Il comporte les cycles suivants:

 

94°  5 minutes    
     
94°  30 secondes }  
54°  30 secondes 40 cycles
72°  30 secondes  
     
72°  5 minutes    

 

  • A la fin de la réaction de PCR les tubes peuvent être gardés au congélateur
  • Arrêter la machine PCR en suivant les indications du mode d’emploi.

 

3) Préparation du gel d’agarose

Le TBE 10x concentré doit être manipulé uniquement par les enseignants ou les préparateurs, en prenant soit de porter une blouse, des lunettes et des gants en nitrile. Le TBE 1x concentré peut sans problème être manipulé par les élèves, à conditions qu’ils respectent les mêmes conditions de sécurité.

Le TBE est toxique pour l’environnement, il ne faut donc pas le jeter à l’évier. Celui-ci doit être récupéré et éliminé par le biais de votre propre filière de traitement des produits chimiques.

Le gel d'agarose est une matrice pour séparer les molécules d'ADN selon leur taille dans un champ électrique. Les petits fragments migrent plus vite que les grands, la concentration d'agarose est choisie en fonction de la taille des fragments à séparer. Ici nous allons utiliser un gel à 1.5% d’agarose.

  • Peser 1.05 g d'agarose et mettez-le dans un Erlenmeyer de 250ml.
  • Ajouter 70 ml de tampon d'électrophorèse (TBE 1x).
  • Faire bouillir  (four à micro-ondes, plaque chauffante ou bec bunsen). Veillez à ne pas que l’agarose déborde en bouillant ! L’agarose fondu est complètement transparent. Au cas où des résidus sont toujours visibles, remettre la solution à chauffer.
  • Laisser refroidir le liquide (à environ 60°C).
  • Ajouter 7 µl de SYBR-safe (intercalant qui permettra de visualiser l’ADN) et mélanger en agitant l’Erlenmeyer.
  • Verser l'agarose dans la cuve préparée avec un peigne pour former les puits (attention si l'agarose est trop chaud la cuve d'électrophorèse se déforme !)

Les cuves d'électrophorèse possèdent des petits blocs en plexi pour protéger les électrodes. Souvent les cuves sont déformées et les blocs ne rentrent plus. Il suffit donc de couper, après solidification du gel, une petite lamelle d’agarose en haut et en bas du gel pour libérer les électrodes.

  • Lorsque le gel est refroidi et solidifié ajouter du tampon d'électrophorèse (TBE 1x) et enlever le peigne.

 

4) Analyse des génotypes sur gel

  • Récupérer vos tubes. Ils contiennent déjà le tampon de charge (rouge) et sont donc prêt à être mis sur gel.
  • Charger le gel:

1er puits: 5 µl de marqueur.

2ème puits et suivants: 20 µl de vos échantillons.

Avant dernier puits: le contrôle négatif.

Dernier puits: le contrôle positif.

  • Allumer le transformateur et faire migrer à 100V (ampérage maximum).
  • Quand le colorant rouge de migration arrive en bas du gel, arrêter le transformateur.
  • Laisser refroidir le gel quelques instants. Eventuellement en le mettant au frigo. L’intensité du signal sera ainsi plus forte.
  • Prendre le gel et visualiser les bandes sous la lampe bleue.
  • Prendre une photo.

 

5) Résultats et discussions

 

 

    • Observez votre génotype et ceux des autres personnes.
    • Calculez la fréquence des génotypes  de la classe.
    • Calculez la fréquence des allèles de la classe.
    • Calculez la valeur de Hardy-Weinberg pour la classe.

Un autre exemple d'analyse de résultats est accessible ici

Matériel fourni:

  • 2x Taq ReadyMix
  • Primers mix
  • DMSO
  • ADN contrôle B2B
  • NaOH 200mM
  • HCl 200mM
  • Tris-HCl 200mM
  • Marqueur de taille (électrophorèse)
  • Solution de SYBR-safe
  • Agarose
  • Tampon d'électrophorèse (TBE 1x)
  • Boîte de pointes jaunes
  • Boîte de pointes bleues
  • Micropipettes P20
  • Micropipettes P200
  • Micropipettes P1000
  • Boite tubes Eppendorf 1,5 ml
  • Boite tubes PCR
  • Portoir tube PCR
  • Portoir tube eppendorf
  • Lampe bleue
  • Cuve d'électrophorèse
  • Bloc chauffant
  • Machine PCR
  • Mini-centrifugeuse
  • Ecouvillons
  • Bouteille d'eau stérile

Matériel non fourni:

L’Université de Genève décline toutes responsabilités en cas de dommages survenus durant les expériences.

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