Expériences
Retroinhibition gene

6.
Rétroinhibition d'un gène

Retroinhibition2

Les cellules de bactéries, levures ou mammifères gèrent avec beaucoup de soin leurs dépenses d'énergie. Si un produit synthétisé par la cellule est déjà présent en abondance à l’intérieur de celle-ci ou dans le milieu extérieur, sa production est bloquée. Souvent ce phénomène est dû à l'interaction du produit final avec une molécule servant comme répresseur de l'expression des gènes de biosynthèse. Ce phénomène, dénommé la rétroinhibition, est représenté dans le schéma ci-dessous.

 

 

Thèmes: Régulation de l'expression d'un gène. Voie métabolique. Rétroinhibition.

 

Introduction :
Dans la levure Saccharomyces cerevisiae, la chaîne de biosynthèse de l’adénine contient une douzaine d‘enzymes. Les gènes codant pour ces enzymes sont dénommés ADE suivit du numéro correspondant à l’ordre de leurs découverte. Cette chaîne permet la conversion du précurseur, le phosphoribosyl-pyrophosphate (P-ribosyl-PP), en adénine comme schématisé ci-dessous.

 

 

Une levure ayant une mutation dans un de ces gènes ne peut pas croître en absence d’adénine dans le milieu. Elle devient alors auxotrophe. Lorsqu’une mutation dans le gène ade2 rend non-fonctionnelle sa protéine, le produit intermédiaire (le P-ribosylamino imidazole) ne peut pas être transformé en produit suivant. Le P-ribosylamino imidazole s’accumule alors dans la cellule où il est oxydé en un pigment rouge par un processus dépendant de la respiration cellulaire. L’accumulation de ce pigment est visible dans les mutants ade2 lorsque l'adénine fournie dans le milieu devient limitante (cliquez ici pour voir l'aspect du mutant ade2). Dans ce cas la cellule enclenche la voie de synthèse de l’adénine qui aboutit à l’accumulation du pigment rouge comme représenté dans le schéma ci-dessus. En absence d’oxygène, la levure est capable de pousser par fermentation. Dans ce cas le produit intermédiaire, l’amino-imidazol-ribotide, n’est pas oxydé et les levures restent blanches.

 

L’EXPERIENCE :

 

1) Protocole:

  • Prélever plusieurs colonies de levures ade2 bien rouges à partir de la boîte que l’on vous a fournie et les mettre en suspension dans 5 ml d’H2O stérile.
  • Vortexer la suspension pour bien resuspendre les levures.
  • Etaler 100 ul sur une boîte SD sans adénine.
  • Placer un petit papier filtre sur la boîte à l’aide de brucelles stériles.
  • Déposer doucement 200 ul de sulfate d’adénine (à 4 g/l) sur le filtre
  • Afin de créer une zone dépourvue d’oxygène il est possible de découper la gélose d’une boîte d'agar 1.5% en 2 parties puis de déposer une moitié délicatement sur votre boîte contenant les levures comme représenté ci-dessous. Essayez d'éviter les bulles d'air entre les deux couches d'agar.

 

 

  • Incuber la boîte à l’envers à 30°C pendant 2 jours.

 

2) Résultat:

Autour du disque les levures arrivent à pousser normalement grâce à l'adénine ajoutée sur le filtre. Autour de cette zone il y a un cercle de levure rouge. Ici la concentration de l'adénine est encore assez élevée pour permettre la croissance des cellules, mais l'adénine présente est rapidement épuisée et les cellules enclenchent la voie de synthèse de l'adénine. Comme nous avons utilisé une souche déficiente pour le gène ade2, les cellules accumulent le pigment rouge. En dehors de cette zone il n'y a pas de croissance des cellules en raison de l'absence d'adénine. Dans la partie couverte par l'agar superposé il n'y a pas d'accumulation du pigment rouge. Ceci est du à l'absence de la respiration dans des conditions d’anaérobies. Il s'avère que la respiration est nécessaire à la synthèse du pigment rouge par un mécanisme non déterminé.  

 

 

Matériel fourni:

  • Souche de levure ade2
  • Boîtes de Petri SD sans adénine
  • Boîte d'agar 1.5%
  • Solution stock d'adénine (4g/l)
  • Filtre rond
  • Micropipettes P200
  • Boîte de pointes jaunes
  • Boîte pipettes Pasteur pour les étalements
  • Rack de 48 tubes stériles pour dilutions
  • Portoirs pour tubes en verre
  • Bouteille d'eau stérile
  • Vortex
  • Sac rouge pour les déchets

Matériel non fourni:

  • Etuve à 37°

L’Université de Genève décline toutes responsabilités en cas de dommages survenus durant les expériences.

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